DNA甲(jiǎ)基化(huà)是哺(bǔ)乳(rǔ)類動物(wù)一個重(zhòng)要的基因(yīn)外遺傳信號。有研究表(biǎo)明,DNA甲基化與大(dà)多數(shù)腫瘤的發生(shēng)相(xiāng)關(guān),抑癌基因啟(qǐ)動(dòng)子CpG島的(dí)高度甲基(jī)化可引起抑(yì)癌(ái)基因表達(dá)沉(chén)默，細胞出(chū)現(xiàn)無節製生長,導致腫瘤的發(fā)生。目(mù)前，基因的(dí)甲基(jī)化研(yán)究主(zhǔ)要結(jié)合亞硫(liú)酸(suān)氫(qīng)鈉處(chǔ)理和PCR技(jì)術(shù)，分為(wéi)甲基(jī)化(huà)特(tè)異(yì)性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫(liú)化測序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。
甲基化特異性的PCR（MSP）原理：
雙鏈DNA變性解(jiě)鏈(liàn)後，在HSO3-作用下(xià)發生C→U轉化，C若已(yǐ)有甲基化則無此改變(biàn)；甲(jiǎ)基(jī)化修飾(shì)隻發(fā)生於5′→3′方向C-G相(xiāng)聯(lián)結(jié)構(gòu)的(dí)C上，因此(cǐ)在HSO3-作用(yòng)後，DNA CpG島(dǎo)若無甲(jiǎ)基化，則(zé)序列(liè)中的改(gǎi)變為(wéi)C→U，CG→UG，若(ruò)有甲基(jī)化則(zé)為C→U，CG→CG，用(yòng)不同(tóng)的引物做(zuò)PCR，即可檢測(cè)出(chū)這種差異(yì)，從(cóng)而確定基因(yīn)有無(wú)CpG島甲基化。從(cóng)理論上說(shuō)，DNA發(fā)生甲(jiǎ)基化(huà)的MSP產(chǎn)物(wù)的(dí)序列與原序列(liè)比較，變化(huà)為(wéi)C→T，CG→CG，相應其互補鏈(liàn)的(dí)改變為(wéi)G→A，CG→CG。然後設(shè)計針對(duì)甲基(jī)化和非(fēi)甲(jiǎ)基化(huà)序列(liè)的(dí)引(yǐn)物並進(jìn)行(háng)聚合酶鏈(liàn)反(fǎn)應（PCR）擴增(zēng)，zui後通過(guò)瓊脂(zhī)糖凝(níng)膠(jiāo)電(diàn)泳分析，確定(dìng)與(yǔ)引物(wù)互補的DNA序列(liè)的甲(jiǎ)基化狀態。MSP法(fǎ)靈(líng)敏(mǐn)度較高(gāo)，應用範(fàn)圍廣。
硫化測(cè)序(xù)PCR（BSP）原(yuán)理：
結合重(zhòng)亞硫(liú)酸(suān)鹽的測序法是(shì)一種靈(líng)敏(mǐn)的(dí)能(néng)直(zhí)接(jiē)檢測(cè)分析(xī)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA甲(jiǎ)基化(huà)模式的方(fāng)法。重(zhòng)亞硫(liú)酸鹽處理(lǐ)後，用針對(duì)改變後的DNA序列(liè)設(shè)計特異(yì)性引(yǐn)物(wù)並(bìng)進行聚合(hé)酶鏈式反(fǎn)應（PCR）。 PCR產物(wù)中原先(xiān)非(fēi)甲基化的胞嘧(mì)啶(dìng)位(wèi)點被胸腺嘧啶所替(tì)代，而甲基化的胞嘧(mì)啶位(wèi)點(diǎn)保持不變。PCR產物(wù)克(kè)隆後進行測(cè)序(xù)。通(tōng)過(guò)這(zhè)個(gè)方法能得到(dào)特定位點在各(gè)個基(jī)因(yīn)組DNA分子中的(dí)甲(jiǎ)基(jī)化狀(zhuàng)態(tài)。
甲基(jī)化(huà)服務流程：
1） 根(gēn)據目的(dí)基(jī)因啟動子(zǐ)序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引(yǐn)物(wù)；
2） 基因組(zǔ)DNA的提(tí)取和定量；
3） 亞(yà)硫酸氫(qīng)鈉(nà)修飾基(jī)因(yīn)組DNA；
4） 修(xiū)飾(shì)後DNA純化回(huí)收；
5） a，結合(hé)實時定(dìng)量(liáng)PCR的qMSP；
b，BSP，對(duì)PCR產(chǎn)物進行(háng)測序(xù)並與(yǔ)未(wèi)經處(chǔ)理的(dí)序列(liè)比較；
6） 數據處理；
7） 向客戶提(tí)交數據分析(xī)結果與(yǔ)實驗報告。
樣品要(yào)求：
盡可能新鮮和足量的組織(zhī)（≥50mg），細(xì)胞(bāo)樣品（≥106）或(huò)全血(xiě)（≥300μl），或直接(jiē)提供純化好(hǎo)的DNA（≥5μg/樣(yàng)品(pǐn)）。
基因甲(jiǎ)基(jī)化檢測
甲基化是(shì)在DNA甲基(jī)轉(zhuǎn)移(yí)酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化(huà)作用下(xià), 利用S-腺(xiàn)苷(gān)甲(jiǎ)硫(liú)氨酸(suān)（S-adenosylmethionine, SAM）提(tí)供(gōng)甲基，在(zài)CpG二核苷酸中(zhōng)胞(bāo)嘧啶(dìng)嘧啶(dìng)環的(dí)五(wǔ)號碳原子(zǐ)上(shàng)加(jiā)上甲(jiǎ)基的共(gòng)價修(xiū)飾過程.
DNA甲(jiǎ)基(jī)化(huà)是表(biǎo)觀(guān)遺傳(chuán)修飾的主要方式，它不(bù)改變DNA的一級(jí)結(jié)構，卻(què)在(zài)細胞的(dí)發育，基因的(dí)表(biǎo)達(dá)，及(jí)基(jī)因組的(dí)穩(wěn)定(dìng)性(xìng)中(zhōng)起著重要(yào)的作(zuò)用。
CpG島的(dí)高甲基化是(shì)腫(zhǒng)瘤(liú)中(zhōng)存在的(dí)普遍(biàn)現(xiàn)象(xiàng)，而(ér)啟動子(zǐ)CpG 島(dǎo)的高甲(jiǎ)基(jī)化(huà)是除(chú)突變(biàn)和(hé)缺(quē)失外(wài)腫(zhǒng)瘤(liú)中抑癌基因(yīn)失(shī)活的(dí)第三種(zhǒng)機(jī)製。
因(yīn)此，基因(yīn)啟動(dòng)子甲(jiǎ)基(jī)化檢測在臨床診斷（如甲(jiǎ)基化檢測(cè)與(yǔ)低劑(jì)量CT相結合(hé)），藥(yào)物敏感性檢(jiǎn)測等方(fāng)麵具有很高的(dí)應(yīng)用價(jià)值。
目(mù)前(qián)甲基(jī)化特異(yì)性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）及(jí)其改進(jìn)方法是檢(jiǎn)測(cè)基(jī)因甲基(jī)化的(dí)經(jīng)典方(fāng)法(fǎ)．MSP法(fǎ)的原(yuán)理是首先(xiān)用亞硫酸氫鈉(nà)修飾處理(lǐ)基因組DNA，所有未發生(shēng)甲基(jī)化(huà)的(dí)胞(bāo)嘧啶都被(bèi)轉化(huà)為(wéi)尿(niào)嘧(mì)啶，而甲基化的(dí)胞嘧啶(dìng)則(zé)不(bù)變。然後設計(jì)針(zhēn)對甲基(jī)化(huà)和(hé)非(fēi)甲(jiǎ)基化(huà)序(xù)列(liè)的(dí)引物(wù)並進行(háng)聚合酶鏈反應（PCR）擴(kuò)增，zui後(hòu)通過瓊脂糖凝膠電泳分(fēn)析，確定與引物(wù)互補(bǔ)的(dí)DNA序列(liè)的(dí)甲(jiǎ)基(jī)化(huà)狀態(tài)。
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