非洲(zhōu)豬瘟病(bìng)毒熒(yíng)光PCR檢測試(shì)劑盒操(cāo)作(zuò)步驟
獸(shòu)用
【獸藥名稱】
通用名稱(chēng)：非洲(zhōu)豬瘟病毒(dú)熒光PCR檢(jiǎn)測試劑盒
漢語拼音(yīn)：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe
英(yīng)文名(míng)稱：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit
商品名稱：無(wú)
【主要(yào)成分與含(hán)量】
【作用(yòng)與(yǔ)用(yòng)途】 用於(yú)血液(yè)，血(xiě)球粉，淋(lín)巴(bā)結(jié)，脾髒，扁桃體(tǐ)中(zhōng)非(fēi)洲豬瘟(wēn)病毒核酸的(dí)檢測。
【用法與判定(dìng)】
1 用法(fǎ)
1.1 樣(yàng)品(pǐn)處(chǔ)理
血液(yè)樣品直(zhí)接(jiē)用；淋巴(bā)結，脾髒，扁桃體樣(yàng)品，用無(wú)菌的剪刀和鑷(niè)子(zǐ)剪取(qǔ)待(dài)檢樣品2.0 g於(yú)研(yán)缽中(zhōng)充分研磨，再加(jiā)10.0 mL PBS（pH 7.2，含(hán)1萬單(dān)位青黴素和1萬單位鏈黴(méi)素(sù)）用MixMax漩渦(wō)振(zhèn)蕩器混匀（樣(yàng)品不(bù)足(zú)2.0 g按1:5比(bǐ)例(lì)加PBS），對(duì)處(chǔ)理的(dí)待檢(jiǎn)樣(yàng)品置70℃，30分(fēn)鐘滅(miè)活(huó)後，3 000 r/min，4 ℃離(lí)心5分(fēn)鐘，取上清(qīng)液，編號備用(yòng)；血(xiě)球(qiú)粉處理同上，隻不過省(shěng)掉研磨步驟。
1.2 樣品存放(fàng)
采集或(huò)處理(lǐ)好(hǎo)的(dí)樣品(pǐn)在2℃～8℃條件(jiàn)下(xià)保存應不超(chāo)過24 h；若(ruò)需長期保(bǎo)存，須(xū)放(fàng)置(zhì)-80 ℃冰箱，但(dàn)應避(bì)免反復(fù)凍(dòng)融（凍融不超(chāo)過(guò)3次(cì)）。
1.3 操作(zuò)步驟(zhòu)
1.3.1 病(bìng)毒DNA的提取(qǔ)（使(shǐ)用A盒）
（1）待(dài)檢(jiǎn)樣品，陽性對照和(hé)陰性(xìng)對照的份數總(zǒng)和用(yòng)n表示(shì)，取n個滅菌(jūn)的(dí)1.5 mL離心(xīn)管，逐管(guǎn)編(biān)號(hào)。
（2）每管加入Buffer A 500 mL。
（3）每(měi)管分別加入(rù)已處理(lǐ)的(dí)待檢樣品，陽(yáng)性對(duì)照，陰性(xìng)對照(zhào)各(gè)200 mL，充(chōng)分混匀(yún)，室溫放置(zhì)10分鐘(zhōng)。
（4）取(qǔ)與(yǔ)上(shàng)述離(lí)心(xīn)管(guǎn)等量的DNase-Free吸(xī)附柱和收集管(guǎn)，編號。將(jiāng)離心管(guǎn)中的溶(róng)液轉(zhuǎn)移(yí)至DNase-Free吸附柱，（為(wéi)避免(miǎn)堵塞吸附柱，盡量不要(yào)吸(xī)懸浮雜質）。
（5）用TH-15高(gāo)速(sù)離心機設置13000 r/min室溫(wēn)離(lí)心30秒(miǎo)。
（6）棄去收集(jí)管液體(tǐ)，將吸(xī)附柱(zhù)放回收(shōu)集(jí)管中(zhōng)。
（7）吸(xī)附(fù)柱內加(jiā)入(rù)600 μL Buffer B，13000 r/min離(lí)心30秒(miǎo)。
（8）棄去收(shōu)集管液體，將吸(xī)附(fù)柱放回(huí)收集管中。
（9）重(zhòng)復步驟（7），（8）。
（10）13000 r/min空(kōng)柱離(lí)心2分(fēn)鐘，去除殘(cán)留液。
（11）將每(měi)個吸附(fù)柱分別移入(rù)新(xīn)的(dí)1.5mL離心管(guǎn)中，向柱中央(yāng)加入(rù)50 μL Buffer C，室溫靜(jìng)置1分(fēn)鐘，13000 r/min離心30秒(miǎo)，離心(xīn)管中(zhōng)液體(tǐ)即為(wéi)模(mó)板(bǎn)DNA。獲得的(dí)DNA溶(róng)液(yè)，冰上(shàng)保存備用(yòng)（注(zhù)意提取的(dí)DNA須在2 h內進行PCR 擴增，若需長期(qī)保(bǎo)存(cún)須放置-80 ℃冰箱，但應避免反復凍融(róng)）。
1.3.2 熒(yíng)光(guāng)PCR擴增(zēng)（使(shǐ)用(yòng)B盒）
（1）從(cóng)試(shì)劑(jì)盒(hé)中(zhōng)取(qǔ)出熒(yíng)光PCR反應(yīng)液，Taq酶(méi)，室溫融化(huà)後(hòu)，2 000 r/min離(lí)心5秒。設(shè)所需(xū)PCR管(guǎn)數為n（n = 樣(yàng)本(běn)數(shù)+1管(guǎn)陰性對(duì)照+1管(guǎn)陽性對(duì)照），每個測試(shì)反應(yīng)體係(xì)需要20 μL 熒光(guāng)PCR反(fǎn)應液(yè)和0.5 μL Taq酶(méi)。計算(suàn)好(hǎo)各試劑(jì)的(dí)使用量(liáng)，加(jiā)入一適當體積(jī)小管中(zhōng)，充(chōng)分混(hùn)合(hé)均(jūn)匀後，向(xiàng)每個PCR管中各(gè)分裝20 μL。
（2）分別(bié)向上(shàng)述(shù)PCR管中加入1.3.1（11）中製(zhì)備(bèi)的DNA溶(róng)液(yè)各5μL，蓋緊(jǐn)管蓋，500 r/min 離(lí)心(xīn)30秒(miǎo)。
（3）將加樣後的(dí)PCR管放(fàng)入(rù)熒光(guāng)PCR檢(jiǎn)測(cè)儀(yí)內(nèi)，作好標記(jì)。反應(yīng)參(cān)數設(shè)置(zhì)：
階段(duàn)，預變性95℃/3分(fēn)鐘
第(dì)二(èr)階(jiē)段，95℃/15秒(miǎo)，52℃/10秒，60℃/35秒共45個(gè)循(xún)環(huán)。熒光(guāng)收集在第二(èr)階段每次循(xún)環的(dí)60℃延伸時(shí)進行。
2 判定(dìng)
2.1 結果分(fēn)析條(tiáo)件的設定
閾(yù)值設(shè)定原(yuán)則：根(gēn)據儀器(qì)噪聲情況(kuàng)進行調整，以閾值綫剛好(hǎo)超過(guò)陰(yīn)性對照品(pǐn)擴增(zēng)曲(qū)綫(xiàn)的高點(diǎn)為(wéi)準。對(duì)於(yú)多(duō)通道(dào)熒(yíng)光(guāng)PCR儀，選(xuǎn)定(dìng)FAM(465-510)檢測通道讀(dú)取檢測(cè)結(jié)果，ABI儀器選擇(zé)FAM無熒(yíng)光淬滅基團。
2.2 質控標準(zhǔn)
2.2.1 陰性(xìng)對(duì)照(zhào)無Ct值(zhí)並(bìng)且(qiě)無(wú)擴(kuò)增曲綫(xiàn)。
2.2.2 陽(yáng)性對照的(dí)Ct值應小(xiǎo)於(yú)等(děng)於(yú)28，並(bìng)出現(xiàn)典(diǎn)型(xíng)的(dí)擴增曲綫。
2.2.3 如陰性(xìng)和陽性(xìng)對(duì)照不滿足(zú)以上條件，此次實驗視為無效。
2.3 結(jié)果(guǒ)判定(dìng)
2.3.1 陰(yīn)性：無Ct值，且(qiě)無(wú)特(tè)征(zhēng)性擴增(zēng)曲綫，表明樣(yàng)品為陰(yīn)性(xìng)。
2.3.2 陽性(xìng)：Ct值≤38.0，且出現(xiàn)典型的擴增(zēng)曲綫(xiàn)，表示樣(yàng)品(pǐn)為陽(yáng)性。
2.3.3 Ct值大於(yú)38.0，且出(chū)現典(diǎn)型的擴增(zēng)曲綫的(dí)樣品建議復(fù)驗。復驗(yàn)仍(réng)出現(xiàn)上(shàng)述結果的(dí)，判(pàn)為(wéi)陽(yáng)性，否則(zé)判為陰性(xìng)。
【注意(yì)事項(xiàng)】
1 實(shí)驗(yàn)室(shì)應(yīng)至少(shǎo)分(fēn)三(sān)個區：樣品(pǐn)處(chǔ)理(lǐ)區，反(fǎn)應(yīng)混合(hé)物配製區和檢(jiǎn)測(cè)區(qū)。
2 各(gè)區物品(pǐn)均(jūn)為，不(bù)得(dé)交叉使用，避免汙染(rǎn)。檢測結(jié)束後，應立即(jí)對(duì)工作(zuò)台進(jìn)行(háng)清(qīng)潔。
3 Buffer A有(yǒu)很(hěn)強(qiáng)的腐蝕(shí)性，切(qiē)勿沾(zhān)到(dào)皮(pí)膚或(huò)衣服上(shàng)，否(fǒu)則應立(lì)即(jí)用(yòng)大(dà)量(liáng)清(qīng)水(shuǐ)衝洗並擦幹(gān)。
4 在整個檢測過程中應注(zhù)意避(bì)免交叉汙(wū)染：提取核(hé)酸(suān)時應用(yòng)滅菌的(dí)鑷子夾取離心(xīn)管；對(duì)離(lí)心(xīn)管(guǎn)開蓋時(shí)應(yīng)避免粘在(zài)手上或(huò)濺出，否則(zé)要立(lì)即更換(huàn)手套。
5 反應(yīng)液(yè)在(zài)使(shǐ)用前(qián)要*融化(huà)，並(bìng)將反應液(yè)與(yǔ)Taq酶瞬(shùn)時(shí)離(lí)心將液體(tǐ)甩至管底。分(fēn)裝(zhuāng)反(fǎn)應液時，應盡量(liáng)避免(miǎn)產生(shēng)氣(qì)泡(pào)。上(shàng)機(jī)前注(zhù)意檢查各反應管是否(fǒu)蓋緊，以免熒(yíng)光(guāng)物質(zhì)泄(xiè)露汙染儀器。
6 陽(yáng)性(xìng)對照(zhào)在(zài)吸(xī)取(qǔ)前(qián)應(yīng)在(zài)微量(liáng)漩(xuán)渦(wō)振蕩器(qì)上劇(jù)烈振(zhèn)蕩1～2秒(miǎo)。
7 試(shì)劑盒(hé)中(zhōng)各組(zǔ)分應(yīng)避免(miǎn)反復凍融(róng)。
8 對樣品及(jí)其(qí)廢棄物的操作(zuò)應嚴(yán)格遵守(shǒu)生物安(ān)全(quán)規定。
9 本試劑盒(hé)僅供獸醫(yī)及(jí)相關專(zhuān)業(yè)人士使用。
【貯藏與有效(xiào)期】 非洲(zhōu)豬(zhū)瘟(wēn)病(bìng)毒(dú)熒(yíng)光(guāng)PCR檢測試劑盒(hé)的A盒室溫(wēn)保存(cún)，B盒在-20℃保(bǎo)存(cún)，有效(xiào)期為12個(gè)月(yuè)。
【規(guī)格】 48檢(jiǎn)測/盒
聯(lián)係(xì)方(fāng)式
郵(yóu)件：[email protected]